山西药科职业学院课题成果公报
公报登记号：SXYK202003
单位名称：山西药科职业学院
课题名称：地黄生长发育过程中根际土壤微生物的动态变化
课题责人：徐丽霞
课题批准号：201804038
课题成员：蔡翠芳等
正文：
一、内容与方法
（一）研究内容
1. 地黄产量和感病率的统计。
2. 不同根际土壤理化性质包括：土壤含水量、pH值、有机碳、全氮、全磷、全钾、有效氮、有效磷和有效钾含量测定。
3. 不同根际土壤不同根际土壤多酚氧化酶、抗氧化物酶、过氧化氢酶、磷酸酶、蔗糖酶和脲酶的测定。
4. 不同根际土壤细菌和真菌多样性和群落组成分析。
（二）研究方法
1. 土壤养分的测定
通过Walkley-Black的方法、凯氏定氮法、钼-锑比色法、火焰原子吸收分光光度法、碱裂解扩散法、Olsen的方法和火焰原子吸收分光光度法分别测定土壤有机碳、总氮、总磷、总钾、有效氮、有效磷和有效钾。采用IQ150/pH计（Spectrum1 Technologies Inc.，Aurora，IL，USA）在土壤/水1:5的情况下测定土壤pH。采用氯仿-K2SO4熏蒸法萃取土壤微生物生物量碳（MBC），校正因子为0.33。采用Brookes等的方法测量土壤微生物生物量氮（MBN），校正因子为0.54。
2．土壤酶活性的测定
将5.0 g土壤样品放入150 ml锥形瓶均匀摇动20 min后，加入0.3 ％（w/ v）H2O2，然后加入1.5 M H2SO4，最后过滤。用0.1 M KMnO 4滴定滤液，以1 h后1 g土壤消耗0.1 mol L-1 KMnO4的毫升量表示。
称取2.0 g新鲜土，置于50 ml三角瓶中，加15 ml 8％蔗糖溶液，5 ml pH 5.5磷酸缓冲液和0.25 ml甲苯。摇匀放入恒温箱， 37 ℃培养24 h后过滤。取滤液1 ml加入50 ml容量量瓶中，加入3 ml 3，5-二硝基水杨酸后沸水浴5 min后冷却。用蒸馏水稀释至50 ml，并在分光光度计上于波长508 nm处进行比色测定3-氨基-5-硝基水杨酸。以1 h后1 g土壤产生葡萄糖的μg数表示过纤维素酶的活性。
取5.0 g新鲜土于100 ml锥形瓶中，加入1ml甲苯，放置15 min后，加入5 ml 10％尿素溶液和10 ml柠檬酸缓冲液（pH=6.7），摇匀后放入37 ℃恒温箱中，培养24 h。培养结束后，用38 ℃水稀释至刻度，充分摇荡，并将悬液用滤纸过滤到锥形瓶中。吸取3 ml滤液于50 ml比色管中，加蒸馏水至20 ml，充分震荡，然后加入4 ml苯酚钠，充分混合，再加入3 ml次氯酸钠充分摇荡，放置20 min，用水稀释至刻度，溶液呈现靛酚的蓝色（在1 h内保持稳定）。在分光光度计上用1cm比色杯，于578 nm处进行比色测定。脲酶活性以1 h后1 g土壤中NH3-N的毫克数表示。
将1 g土壤样品与4 mL 0.5％（w / v）苯基磷酸二钠和1 mL甲苯混合，并振摇5 min。将混合物在37 ℃下孵育2 h后过滤。向1 mL滤液中加入25μL硼酸盐缓冲液（pH 8.0），50 μL铁氰化钾和50 μL氨基安替比林。使用分光光度计在510 nm下记录反应混合物的吸光度。用对硝基磷酸苯二钠为基质测定土壤碱性磷酸酶，以1 g土壤1 h产生μmol对硝基苯酚的量表示。
多酚氧化酶活性测定[25]，提取风干土壤样品5 g，用10ml 1%的1,2,3-三羟基苯（添加为底物）摇匀，在30 ℃下孵育3 h，加入4 ml柠檬酸-磷酸缓冲液（pH4.5）和35 ml乙醚，摇晃3 min，静置30 min后，在430 nm处的吸光度，多酚氧化酶活性以2 h后1 g土壤中产生的紫色没食子素的mg数表示。
纤维素酶活性测定，采用蒽酮比色法测定生成葡萄糖含量。称 10g 土壤置于 50 ml 三角瓶中，加入 1.5 ml 甲苯，摇匀后放置 15 min，再加 5 ml 1% 羧甲基纤维素溶液和 5 ml pH 5.5 醋酸盐缓冲液， 将三角瓶放在 37 ℃恒温箱中培养 72 h。培养结束后，过滤并取 1 ml 滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。（为了消除土壤中原有的蔗糖、 葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照， 整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。纤维素酶活性以72 h，1 g 干土生成葡萄糖毫克数表示。
3. 根际土壤DNA提取
用E.Z.N.A.土壤DNA试剂盒（Omega，Inc.）从0.5 g土壤中分离出微生物基因组DNA。
4. 高通量测序
以细菌16s rDNA中V3-V4区和真菌ITS区为靶序列，采用Illumina MiSeq测序平台分析土壤中微生物群落组成。
5. 生物信息学分析
对于从测序平台的得到的数据，从数据库中删除质量低的序列，即模糊碱基，长度<150bp或有两个与引物错配的序列。 最后，重叠的有效序列大于个10bp并且没有任何错配的序列。然后，根据 index 信息提取每个样品的有效序列，对得到的优质序列进行 OTU 的聚类和注释。基于 OTU 聚类和注释的分析结果，绘制稀释曲线，进行多样性指数分析，并在各分类水平上进行群落结构的统计分析和物种丰度差异分析。在上述分析的基础上，进一步对群落结构和系统发育等进行深入的统计学和可视化分析。
6. 差异表达分析
对丰度有差异的类群进行KEGG功能分析，找出与地黄导致地黄连作障碍的微生物种群。
二、结论与对策
（一）结论
（1）测定了地黄苗期和采收期根际土壤的pH值、养分、微生物量碳、微生物量氮的含量：在地黄种植不同时期，土壤有效氮、有效钾、微生物量碳含量和碳氮比均发生改变。与苗期相比，有效氮、有效磷和有效钾含量和碳氮比在采收期显著降低，其中土壤有效氮降低30.43 %，有效磷降低14.04 %， 有效钾降低22.38 %，碳氮比减少41.70 %，土壤微生物碳减少11.90 %，土壤微生物氮减少11.90 %；pH和碳氮比分别降低9.96 %和28. 11 %。
（2）测定了地黄苗期和采收期根际土壤的酶活性:与苗期相比，脲酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶、多酚氧化酶显著升高；过氧化氢酶显著降低；纤维素酶变化不大。其中，过氧化氢酶和多酚氧化酶显著升高，分别增加46.42 %和29.74 %；脲酶、碱性磷酸酶和蔗糖酶显著降低，分别降低53.33 %、28.54 %、37.11 %
（3）分析了地黄苗期和采收期根际土壤细菌群落在门水平组成和结构差异：地黄生长的两个不同时期6个样品所有细菌类群主要分布在29个门，其中Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Bacteroidetes、Firmicutes、Nitrospirae、Planctomycetes、Cyanobacteria、Verrucomicrobia和Armatimonadetes为主要门，这12个门的相对丰度占细菌总量的99％以上。然而，每个门的相对丰度在不同的样品中仍有一些变化。与苗期相比，在采收期Actinobacteria和Acidobacteria的相对丰度分别增加61.46 %7.24 %，Firmicutes变化不大；Gemmatimonadetes和Bacteroidetes的相对丰度分别减小21.69 %和33.30 %。
（4）分析了地黄苗期和采收期根际土壤细菌群落在属水平组成和结构的差异：在属的水平，至少一个处理中平均丰度超过0.1％的属被确定为丰度较大的属，并用于后续的分析。与苗期相比，在采收期RB41、Bacilus、 Pseudarthrobacter、 Haliangium、Sphingomonas、Gaiella、Subgroup 10和Blastococcus的相对丰度在采收期均不同程度增加，最多增加142.49 %、最少增加39.01 %；Nocardioides、Agromyces、Lysobacter、MND1、 Gemmatimonas、Ohtaekwangia、Aeromicrobium、Luteimonas、 Steroidobacter、Microbacterium 的相对丰度在轮作处理中均不同程度减少，最小为3.84 %、最大为39.52 %；Solirubrobacter的相对丰度变化不大。PCA分析显示，不同采收时期土壤细菌群彼此分开，细菌群落组成有差异。
（5）分析了地黄苗期和采收期根际土壤真菌群落在门水平组成和结构的差异：主要真菌门是Ascomycola、Basidiomycota和Mortierellomycota，占真菌序列的77 ％以上。与苗期比，采收期Ascomycola的相对丰度显著减少10.34 %； Basidiomycota和Mortierellomycota 的相对丰度在采收期显著增加95.18 %和353.08 %，育苗期相比显著减小。
（6）分析了地黄苗期和采收期根际土壤真菌群落在属水平组成和结构的差异：在属的水平上，在任何一个样品中相对丰度大于0.1 %的属用于后续分析。与地黄苗期相比，采收期根际土壤Pseudogymnoascus、Cordyceps、Chrysosporium、Pseudaleuria、Aphanoascus、Alternaria、Fusariella、Thelebolus、Preussia、Cladosporium、Humicola、Pyrenochaetopsis、Plectosphaerella、Fusarium、Solicoccozyma、Plectosphaerella和Mortierella、的相对丰度不同程度增加，增加50.39 %-724.11 %；Gibberella、Acaulium、Cephaliophora和Botryotrichum的相对丰度则不同程度减少，减少25.28 %-37.09 %。PCA分析显示，两个样品间彼此分离，同一样品聚在一起，样品间微生物群落差异显著。
（二）对策
从地黄苗期根际土壤中分离得到38株细菌。其中4株菌株在能分泌产吲哚-3-乙酸（IAA），7株菌株具有拮抗地黄根腐病病斑的功能。经测序鉴定，能分泌IAA的菌株属于Streptomyces spp.。这些前期研究成果在一定程度上证实了我们的推测。下一步我们将对分离的菌株的功能进行验证，探索功能菌株的作用机制，为开发生物菌肥提供实验参考。
三、成果与影响
在该项目的资助下，共撰写论文5 篇，《地黄根际土壤微生态研究进展》、《地黄根种植过程中根际土壤微生物多样性的变化》、《基于16SrDNA高通量测序的玉米根际与非根际土壤细菌多样性比较》、《生地黄煅炭HPLC指纹图谱研究》和《Rotation Cropping Enhances the Microbial Communities in Rhizosphere Soil Associated with Foxtail Millet Downy Mildew Disease Suppression》。
这些论文的发表为找出与地黄导致地黄连作障碍的微生物种群，建立有效缓解措施提供理论依据。
四、改进与完善
通过我们的研究发现了地黄种植一年后根际土壤微生物群落的种类和数量发生了很大的变化，也筛选出了与地黄根腐病发病相关的种群。但在研究过程中及后续的研究中还有很多问题需要进一步研究、探讨和验证。
1.地黄根腐病病菌的拮抗菌的筛选；
2.探索其他能够缓解地黄连作障碍的有效措施，如不同作物轮作、土壤改良等。
